Η κυτταρομετρία ροής είναι μια μέθοδος κυτταρολογικής έρευνας που χρησιμοποιείται για εις βάθος ανάλυση των κυττάρων. Το πλεονέκτημά του είναι ότι σας επιτρέπει να μελετήσετε κάθε κύτταρο ξεχωριστά. Αυτός ο τύπος ανάλυσης βοηθά στην αξιολόγηση πολλών παραμέτρων σε εκατοντάδες κελιά μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. Ως αποτέλεσμα, η κυτταροφθοριμέτρηση θεωρείται μία από τις ταχύτερες και πιο ακριβείς μεθόδους ανάλυσης που είναι διαθέσιμες επί του παρόντος σε επιστήμονες και κλινικούς γιατρούς.
Αρχή
Η αρχή της κυτταρομετρίας ροής βασίζεται στη μέτρηση της σκέδασης του φωτός και της φωταύγειας (φθορισμού) των κυττάρων. Το κυτταρικό εναιώρημα διοχετεύεται ως ρεύμα με υψηλή ταχύτητα μέσω του κυττάρου του κυτταρομέτρου, όπου ακτινοβολείται με λέιζερ. Εκεί εκτελείται και η λεγόμενη υδροδυναμική εστίαση. Ο μηχανισμός του είναι ότι η ροή από την κυψέλη με τα μελετημένα σωματίδια στην έξοδο ρέει στον εξωτερικό πίδακα, ο οποίος έχει μεγαλύτερη ταχύτητα. Ως αποτέλεσμα, τα σωματίδια ευθυγραμμίζονται σε μια διατεταγμένη αλυσίδα.
Τα προ-κύτταρα επισημαίνονται με ειδικές φθορίζουσες βαφές (φθοροχρωματικά). Χάρη σε αυτούς, η ακτίνα λέιζερδιεγείρει μια δευτερεύουσα λάμψη. Τα λαμβανόμενα φωτεινά σήματα καταγράφονται από ανιχνευτές. Στη συνέχεια, οι πληροφορίες υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας αλγόριθμους λογισμικού που σας επιτρέπουν να μετράτε μεμονωμένους πληθυσμούς κυττάρων που διαφέρουν σε ορισμένα κριτήρια.
Έρευνα με συμβατική μικροσκοπία συχνά αποτυγχάνει να διακρίνει μεταξύ διαφορετικών κυττάρων επειδή φαίνονται ίδια. Η κυτταροφθοριμετρία μπορεί να παρέχει άλλα δεδομένα (ακεραιότητα δομής DNA), να αναλύσει την έκφραση πρωτεΐνης, την κυτταρική επιβίωση.
Δεδομένου ότι η διέγερση των φθοριοχρωμάτων απαιτεί δέσμες φωτός με διαφορετικά μήκη κύματος, καθώς και διαφορετικούς τύπους ανιχνευτών, οι σύγχρονες εγκαταστάσεις είναι εξοπλισμένες με πολλά κανάλια ανίχνευσης (από 4 έως 30). Ο αριθμός των εκπομπών λέιζερ μπορεί να είναι από 1 έως 7. Πιο πολύπλοκες συσκευές επιτρέπουν μελέτες πολλαπλών παραμέτρων πολλών ιδιοτήτων σωματιδίων ταυτόχρονα.
Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα
Τα οφέλη της κυτταρομετρίας ροής περιλαμβάνουν:
- υψηλή ταχύτητα επεξεργασίας (καταχώριση έως και 30 χιλιάδων συμβάντων σε 1 δευτερόλεπτο);
- δυνατότητα μελέτης μεγάλου αριθμού κυττάρων (έως 100 εκατομμύρια σε ένα δείγμα);
- Ποσοτικοποίηση της έντασης του φωτός φθορισμού;
- ανάλυση κάθε κυττάρου;
- ταυτόχρονη μελέτη ετερογενών διεργασιών;
- αυτόματος διαχωρισμός δεδομένων κατά πληθυσμούς κυττάρων;
- οπτικοποίηση ποιότητας των αποτελεσμάτων.
Ένα άλλο χαρακτηριστικό αυτής της τεχνολογίας είναι ότιτο αναλυόμενο σωματίδιο μπορεί να χρωματιστεί με πολλά φθορίζοντα διαλύματα. Χάρη σε αυτό, πραγματοποιείται μια μελέτη πολλών παραμέτρων.
Τα μειονεκτήματα περιλαμβάνουν την πολυπλοκότητα του τεχνικού εξοπλισμού και την ανάγκη για ειδική προετοιμασία του δείγματος.
Κυττόμετρα
Οι πρώτες συσκευές αυτού του τύπου εμφανίστηκαν ήδη το 1968 στη Γερμανία, αλλά έγιναν ευρέως διαδεδομένες πολύ αργότερα. Επί του παρόντος, όλες οι συσκευές που λειτουργούν με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής μπορούν να χωριστούν σε 2 τύπους:
- συσκευές που μετρούν την ακτινοβολία φθορισμού (δύο ή περισσότερα μήκη κύματος), τη σκέδαση φωτός 10° και 90° (ανιχνευτής χαμηλής γωνίας και πλευρικής διασποράς),
- συσκευές που, εκτός από τη μέτρηση πολλών παραμέτρων κινητής τηλεφωνίας, ταξινομούνται αυτόματα σε ομάδες σύμφωνα με αυτά τα κριτήρια.
Ο ανιχνευτής διασποράς προς τα εμπρός έχει σχεδιαστεί για να προσδιορίζει το μέγεθος του κυττάρου και η συσκευή πλευρικής διασποράς σάς επιτρέπει να λαμβάνετε πληροφορίες σχετικά με την παρουσία ενδοκυτταρικών κόκκων, την αναλογία όγκου του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα.
Τα κλασικά κυτταρόμετρα, σε αντίθεση με τα μικροσκόπια φωτός, δεν επιτρέπουν τη λήψη εικόνας κυττάρου. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, έχουν αναπτυχθεί συνδυασμένες συσκευές που είναι σε θέση να συνδυάζουν τις δυνατότητες ενός μικροσκοπίου και ενός κυτταροφθορόμετρου. Θα συζητηθούν παρακάτω.
Κυτταρόμετρα απεικόνισης
Για όργανα που χρησιμοποιούνται στην κλασική κυτταρομετρία ροής,ένα χαρακτηριστικό είναι χαρακτηριστικό: εάν καταγράφονται σπάνια συμβάντα στον πληθυσμό των αναλυόμενων κυττάρων, τότε δεν υπάρχει τρόπος να εκτιμηθεί ποια είναι η ουσία τους. Αυτά τα σωματίδια μπορεί να είναι είτε υπολείμματα νεκρών κυττάρων είτε μια σπάνια ομάδα αυτών. Στις συμβατικές συσκευές, τέτοια δεδομένα εξαιρούνται από τη γενική ροή των γεγονότων, αλλά είναι αυτά που μπορούν να έχουν ιδιαίτερη αξία για επιστημονική και κλινική ανάλυση.
Η νέα γενιά κυτταρομέτρων ροής απεικόνισης σάς επιτρέπει να τραβήξετε μια εικόνα κάθε κυττάρου που διέρχεται στη ροή μέσω της ζώνης ανιχνευτή. Είναι εύκολο να το δείτε κάνοντας κλικ στην αντίστοιχη περιοχή του διαγράμματος, η οποία εμφανίζεται στην οθόνη του υπολογιστή.
Περιοχές εφαρμογής
Η κυτταρομετρία ροής είναι μια καθολική μέθοδος που χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς της ιατρικής και της επιστήμης:
- ανοσολογία;
- ογκολογία;
- μεταμοσχευτική (μεταμόσχευση ερυθρού μυελού των οστών, βλαστοκύτταρα);
- αιματολογία;
- τοξικολογία;
- βιοχημεία (μέτρηση οξύτητας μέσα στο κύτταρο, μελέτη άλλων παραμέτρων);
- φαρμακολογία (δημιουργία νέων φαρμάκων);
- μικροβιολογία;
- παρασιτολογία και ιολογία;
- ωκεανολογία (η μελέτη του φυτοπλαγκτού για την αξιολόγηση της κατάστασης των υδάτινων σωμάτων και άλλων εργασιών),
- νανοτεχνολογία και ανάλυση μικροσωματιδίων.
Ανοσολογία
Το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται από μια μεγάλη ποικιλία κυττάρων. Η κυτταρομετρία ροής στην ανοσολογία καθιστά δυνατή την αξιολόγηση της δομής και των λειτουργιών τους, δηλαδή τη διεξαγωγή μορφολειτουργικώνανάλυση.
Τέτοιες έρευνες βοηθούν στην κατανόηση της περίπλοκης φύσης της ανοσίας. Οι κυτταρικοί φαινότυποι αλλάζουν ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησης από αντιγόνα, της ανάπτυξης παθολογιών και άλλων παραγόντων. Η κυτταροφθορομετρία μπορεί να διαχωρίσει υποπληθυσμούς ανοσοκυττάρων σε ένα σύνθετο μείγμα και να αξιολογήσει όλες τις αλλαγές τους με την πάροδο του χρόνου.
Ογκολογία
Ένα από τα πιο σημαντικά καθήκοντα στην ογκολογία είναι η διαφοροποίηση των κυττάρων ανάλογα με τον τύπο τους. Η αρχή της ανάλυσης με κυτταρομετρία ροής στην ογκοαιματολογία βασίζεται στο ακόλουθο φαινόμενο: όταν ένα δείγμα υποβάλλεται σε επεξεργασία με μια ειδική φθορίζουσα χρωστική, συνδέεται με τις κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες. Μετά τη διαίρεση σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, η περιεκτικότητά του μειώνεται στο μισό. Αντίστοιχα, η ένταση της κυτταρικής φωταύγειας μειώνεται δύο φορές.
Υπάρχουν άλλοι τρόποι ανίχνευσης πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων:
- χρήση χρωστικών που δεσμεύουν το DNA (ιωδιούχο προπίδιο);
- χρήση επισημασμένης ουρακίλης;
- καταγραφή αυξημένου επιπέδου έκφρασης πρωτεϊνών κυκλίνης, οι οποίες εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.
