Η χρωματογραφία είναι μία από τις μεθόδους διαχωρισμού ουσιών. Χρησιμοποιείται για μετέπειτα ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων των μικροσωματιδίων. Μια παραλλαγή αυτής της τεχνολογίας είναι η χρωματογραφία συγγένειας. Η ιδέα της διαφοροποίησης των πρωτεϊνικών ενώσεων χρησιμοποιώντας την ιδιότητα της μοριακής συγγένειας είναι γνωστή στην επιστήμη εδώ και αρκετές δεκαετίες. Ωστόσο, έχει λάβει την ανάπτυξή του μόνο τα τελευταία χρόνια, μετά την εισαγωγή υδρόφιλων υλικών με υψηλή πορότητα που χρησιμοποιούνται ως μήτρα. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την επίλυση τόσο αναλυτικών προβλημάτων (διαχωρισμός ουσιών και ταυτοποίησή τους) όσο και προπαρασκευαστικών προβλημάτων (καθαρισμός, συγκέντρωση).
Essence
Η χρωματογραφία συγγένειας (από τη λατινική λέξη affinis - «γειτονική», «σχετική») βασίζεται σε αλληλεπιδράσεις συγγένειας, οι οποίες είναι ο σχηματισμός άκρως ειδικών δεσμών μεταξύ ενός μορίου διαχωρισμού (συνδέτης ή συγγενούς) και ενός μορίου στόχου. Αυτοί οι μηχανισμοί είναι ευρέως διαδεδομένοι στη φύση (σύνδεση μεσολαβητών ή ορμονών και υποδοχέων, αντισώματα καιαντιγόνα, υβριδισμός πολυνουκλεοτιδίων και άλλοι τύποι διεργασιών). Στην ιατρική, η χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιείται για πρακτικούς σκοπούς από το 1951
Τα στοιχεία διαχωρίζονται ως εξής:
- διάλυμα εργασίας που περιέχει την προς απομόνωση ουσία διέρχεται μέσω του ροφητικού.
- συνδετήρας που εναποτίθεται στη μήτρα ροφητή διατηρεί αυτήν την ουσία.
- είναι συγκεντρωμένο (συσσώρευση);
- εκχύλιση της απομονωμένης ουσίας από το ροφητικό με έκπλυση με διαλύτη.
Αυτή η μέθοδος σάς επιτρέπει να απομονώνετε ολόκληρα κύτταρα. Η διαφορά από την παραδοσιακή χρωματογραφία προσρόφησης είναι ότι υπάρχει ισχυρή βιοειδική δέσμευση του απομονωμένου συστατικού με το ροφητικό, η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλή εκλεκτικότητα.
προσροφητικά
Οι ακόλουθες ουσίες χρησιμοποιούνται ως προσροφητικά:
- Ενώσεις γέλης με βάση την αγαρόζη, έναν πολυσακχαρίτη που λαμβάνεται από άγαρ. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες είναι 3 ποικιλίες: sepharose 4B, CL (διασταυρούμενη αγαρόζη) και affi-gel. Η τελευταία σύνθεση είναι ένα τροποποιημένο πήκτωμα αγαρόζης και πολυακρυλαμιδίου. Έχει μεγαλύτερη βιολογική αδράνεια, υψηλή χημική και θερμική αντοχή.
- Silica (silica gel).
- Γυαλί.
- Οργανικά πολυμερή.
Για να εξαλειφθούν τα μηχανικά εμπόδια κατά την επαφή του προσδέματος, χρησιμοποιούνται πρόσθετες ουσίες για τον διαχωρισμό του από τον φορέα (πεπτίδια, διαμίνες, πολυαμίνες, ολιγοσακχαρίτες).
Εξοπλισμός
Ο εξοπλισμός χρωματογραφίας συγγένειας περιλαμβάνει τις ακόλουθες κύριες μονάδες:
- δεξαμενές αποθήκευσης για την κινητή φάση (διαλύτης),
- αντλίες υψηλής πίεσης για μεσαία παροχή (τις περισσότερες φορές παλινδρομικές);
- φίλτρο για τον καθαρισμό των διαλυμάτων από τη σκόνη;
- δοσομετρική συσκευή;
- χρωματογραφική στήλη για διαχωρισμό μείγματος;
- ανιχνευτής για ανίχνευση διαχωρισμένων στοιχείων που εγκαταλείπουν τη στήλη;
- καταγραφείς χρωματογράμματος και μονάδα μικροεπεξεργαστή (υπολογιστής).
Για να μειωθεί η ποσότητα του διαλυμένου αέρα, το ήλιο διέρχεται πρώτα από την κινητή φάση. Για να αλλάξετε τη συγκέντρωση του υγρού έκλουσης, εγκαθίστανται πολλές αντλίες που ελέγχονται από τον προγραμματιστή. Οι χρωματογραφικές στήλες είναι κατασκευασμένες από ανοξείδωτο χάλυβα (για αυξημένες απαιτήσεις αντοχής στη διάβρωση), γυαλί (καθολική επιλογή) ή ακρυλικό. Για προπαρασκευαστικούς σκοπούς, η διάμετρός τους μπορεί να κυμαίνεται από 2 έως 70 cm. Στην αναλυτική χρωματογραφία, χρησιμοποιούνται μικροστήλες Ø10-150 μm.
Για να αυξηθεί η ευαισθησία των ανιχνευτών, εισάγονται αντιδραστήρια στο μείγμα, τα οποία συμβάλλουν στο σχηματισμό ουσιών που απορροφούν περισσότερες ακτίνες στην υπεριώδη ή ορατή περιοχή του φάσματος.
Μεθοδολογία
Υπάρχουν 2 κύριοι τύποι χρωματογραφίας υγρής συγγένειας:
- Στήλη, στην οποία η στήλη γεμίζεται με μια στατική φάση και ένα μείγμα διέρχεται μέσω αυτής με ροήεκλούτης. Ο διαχωρισμός μπορεί να συμβεί υπό πίεση ή υπό βαρύτητα.
- Λεπτό στρώμα. Το υγρό έκλουσης κινείται κατά μήκος του επίπεδου προσροφητικού στρώματος υπό την επίδραση τριχοειδών δυνάμεων. Το προσροφητικό εφαρμόζεται σε γυάλινη πλάκα, κεραμική ή ράβδο χαλαζία, μεταλλικό φύλλο.
Κύρια στάδια εργασίας περιλαμβάνουν:
- παρασκευή του προσροφητικού, στερέωση του προσδέματος στον φορέα;
- τροφοδοσία του μίγματος διαχωρισμού στη χρωματογραφική στήλη;
- φόρτωση κινητής φάσης, δέσμευση συστατικού από πρόσδεμα;
- αντικατάσταση φάσης για την απομόνωση της δεσμευμένης ουσίας.
Προορισμός
Χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιείται για την απομόνωση των ακόλουθων τύπων ουσιών (ο τύπος του συνδετήρα που χρησιμοποιείται αναφέρεται σε παρένθεση):
- αναλόγων ενζυματικών αναστολέων, υποστρωμάτων και συμπαραγόντων (ένζυμα);
- βιοοργανικές ουσίες με σημάδια γενετικής αλλοτρίωσης, ιούς και κύτταρα (αντισώματα);
- υψηλού μοριακού βάρους υδατάνθρακες, πολυμερή μονοσακχαριτών, γλυκοπρωτεΐνες (λεκτίνες);
- πυρηνικές πρωτεΐνες, νουκλεοτιδυλοτρανσφεράσες (νουκλεϊκά οξέα);
- υποδοχείς, πρωτεΐνες μεταφοράς (βιταμίνες, ορμόνες);
- πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τις κυτταρικές μεμβράνες (κύτταρα).
Αυτή η τεχνολογία χρησιμοποιείται επίσης για τη λήψη ακινητοποιημένων ενζύμων και η σύνδεσή τους με την κυτταρίνη επιτρέπει την παραγωγή ανοσοροφητικών.
Χρωματογραφία πρωτεϊνών που δεσμεύουν το DNA
Η απομόνωση των πρωτεϊνών που δεσμεύουν το DNA πραγματοποιείται χρησιμοποιώνταςηπαρίνη. Αυτή η γλυκοζαμινογλυκάνη είναι ικανή να δεσμεύει ένα ευρύ φάσμα μορίων. Η χρωματογραφία συγγένειας πρωτεϊνών αυτής της ομάδας χρησιμοποιείται για την απομόνωση ουσιών όπως:
- παράγοντες έναρξης και επιμήκυνσης μετάφρασης (σύνθεση μορίων νουκλεϊκού οξέος και πρωτεϊνών);
- περιοριστάσες (ένζυμα που αναγνωρίζουν ορισμένες αλληλουχίες στο δίκλωνο DNA);
- λιγάσες και πολυμεράσες DNA (ένζυμα που καταλύουν την ένωση δύο μορίων για να σχηματίσουν έναν νέο χημικό δεσμό και εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA);
- αναστολείς πρωτεάσης σερίνης που παίζουν σημαντικό ρόλο στις ανοσολογικές και φλεγμονώδεις διεργασίες,
- αυξητικοί παράγοντες: ινοβλάστες, Schwann, ενδοθηλιακός;
- πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας;
- υποδοχείς ορμονών;
- λιποπρωτεΐνες.
Αξιοπρέπεια
Η μέθοδος αυτή είναι από τις πιο ειδικές για την απομόνωση δραστικών ενώσεων (ένζυμα και μεγαλύτερα συσσωματώματα - ιοί). Ωστόσο, δεν χρησιμοποιείται μόνο για την απομόνωση βιολογικά δραστικών ουσιών.
Ανίχνευση αντισωμάτων σε μικρές ποσότητες, ποσοτική εκτίμηση πολυαδενυλικού οξέος, γρήγορος προσδιορισμός των μοριακών μαζών αφυδρογονασών, απομάκρυνση ορισμένων ρύπων, μελέτη της κινητικής ενεργοποίησης της ανενεργής μορφής θρυψίνης, η μοριακή δομή του ανθρώπου ιντερφερόνες - αυτός δεν είναι ολόκληρος ο κατάλογος των μελετών στις οποίες χρησιμοποιείται η συγγένεια.χρωματογραφία. Η χρήση στην κλινική οφείλεται στα πλεονεκτήματά της όπως:
- Αποτελεσματική ικανότητα καθαρισμούπρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, νουκλεϊκά οξέα. Διαφέρουν ελαφρώς στις φυσικές και χημικές τους ιδιότητες και χάνουν τη δραστηριότητα τους κατά την υδρόλυση, τη μετουσίωση και άλλους τύπους επεξεργασίας που χρησιμοποιούνται σε άλλες μεθόδους.
- Η ταχύτητα διαχωρισμού των ουσιών, η δυναμική φύση της διαδικασίας.
- Δεν χρειάζεται ειδικός καθαρισμός ενζύμων και ισοενζυμική ομογενοποίηση για τον προσδιορισμό των σταθερών διάστασης.
- Ικανότητα να διαχωρίσει ένα ευρύ φάσμα ουσιών.
- Χαμηλή κατανάλωση προσδεμάτων.
- Δυνατότητα διαχωρισμού ουσιών σε μεγάλους όγκους.
- Αναστρέψιμη διαδικασία δέσμευσης βιολογικών μακρομορίων.
Αυτή η τεχνική μπορεί να συνδυαστεί με άλλες, για να επιβάλει ένα επιπλέον πεδίο (βαρυτικό, ηλεκτρομαγνητικό). Αυτό σας επιτρέπει να επεκτείνετε τις τεχνικές δυνατότητες της χρωματογραφίας.
Ενζυμική μηχανική
Χάρη σε αυτή τη μέθοδο, ξεκίνησε η ενεργός ανάπτυξη ενός νέου κλάδου της βιοτεχνολογίας - μηχανικής ενζύμων.
Η χρωματογραφία συγγένειας για την απομόνωση ενζύμων έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα:
- απόκτηση ενζύμων σε μεγάλες ποσότητες ως αποτέλεσμα λιγότερου χρόνου, ως αποτέλεσμα - μείωση της τιμής τους;
- η ακινητοποίηση των ενζύμων μπορεί να διευρύνει σημαντικά το πεδίο εφαρμογής τους στην ιατρική και τη βιομηχανία.
- Η σύνδεση των ενζύμων με ένα αδιάλυτο στερεό υπόστρωμα καθιστά δυνατή τη μελέτη της επίδρασης του μικροπεριβάλλοντος και της κατεύθυνσης των αντιδράσεων, που παίζουν σημαντικό ρόλο στις φυσικές και φυσιολογικές διεργασίες.
