Το ανασυνδυασμένο DNA είναι μόρια που σχηματίζονται από τεχνικές εργαστηριακού γενετικού ανασυνδυασμού για συνδυασμό γενετικού υλικού από πολλαπλές πηγές. Είναι πιθανό επειδή τα μόρια DNA όλων των οργανισμών έχουν την ίδια χημική δομή και διαφέρουν μόνο στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων μέσα σε αυτό.
Δημιουργία
Η μοριακή κλωνοποίηση είναι μια εργαστηριακή διαδικασία που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA. Είναι μία από τις δύο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους, μαζί με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Σας επιτρέπει να ελέγχετε την αντιγραφή οποιασδήποτε συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA που έχει επιλεγεί από τον πειραματιστή.
Υπάρχουν δύο θεμελιώδεις διαφορές μεταξύ των μεθόδων ανασυνδυασμένου DNA. Το ένα είναι ότι η μοριακή κλωνοποίηση περιλαμβάνει αντιγραφή σε ζωντανό κύτταρο, ενώ η PCR περιλαμβάνει in vitro. Μια άλλη διαφορά είναι ότι η πρώτη μέθοδος επιτρέπει την κοπή και επικόλληση αλληλουχιών DNA, ενώ η δεύτερη ενισχύεται με την αντιγραφή της υπάρχουσας σειράς.
Δνυσματικό DNA
Η λήψη ανασυνδυασμένου DNA απαιτεί φορέα κλωνοποίησης. Προέρχεται από πλασμίδια ή ιούς και είναι ένα σχετικά μικρό τμήμα. Η επιλογή του φορέα για μοριακή κλωνοποίηση εξαρτάται από την επιλογή του οργανισμού ξενιστή, το μέγεθος του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί και από το αν πρόκειται να εκφραστούν ξένα μόρια. Τα τμήματα μπορούν να συνδυαστούν χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους, όπως κλωνοποίηση περιοριστικού ενζύμου/λιγάσης ή συναρμολόγηση Gibson.
Κλωνοποίηση
Στα τυπικά πρωτόκολλα, η κλωνοποίηση περιλαμβάνει επτά βήματα.
- Επιλέξτε οργανισμό ξενιστή και φορέα κλωνοποίησης.
- Λήψη φορέα DNA.
- Σχηματισμός κλωνοποιημένου DNA.
- Δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA.
- Εισαγωγή του στον οργανισμό ξενιστή.
- Επιλογή οργανισμών που το περιέχουν.
- Επιλογή κλώνων με επιθυμητά ένθετα DNA και βιολογικές ιδιότητες.
Μετά τη μεταμόσχευση στον οργανισμό ξενιστή, τα ξένα μόρια που περιέχονται στο ανασυνδυασμένο μόρφωμα μπορεί να εκφραστούν ή να μην εκφραστούν. Η έκφραση απαιτεί αναδιάρθρωση του γονιδίου ώστε να περιλαμβάνει αλληλουχίες που είναι απαραίτητες για την παραγωγή DNA. Χρησιμοποιείται από τη μηχανή μετάφρασης του οικοδεσπότη.
Πώς λειτουργεί
Το ανασυνδυασμένο DNA λειτουργεί όταν το κύτταρο ξενιστής εκφράζει μια πρωτεΐνη από ανασυνδυασμένα γονίδια. Η έκφραση εξαρτάται από το περιβάλλον του γονιδίου με ένα σύνολο σημάτων που παρέχουν οδηγίες για τη μεταγραφή του. Περιλαμβάνουν προαγωγέα, δέσμευση ριβοσώματος και τερματιστή.
Προβλήματα προκύπτουν εάν το γονίδιοπεριέχει εσώνια ή σήματα που λειτουργούν ως τερματιστές για τον βακτηριακό ξενιστή. Αυτό οδηγεί σε πρόωρο τερματισμό. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μπορεί να υποστεί ακατάλληλη επεξεργασία, να διπλωθεί ή να αποικοδομηθεί. Η παραγωγή του σε ευκαρυωτικά συστήματα συμβαίνει συνήθως σε ζυμομύκητες και νηματώδεις μύκητες. Η χρήση κλουβιών ζώων είναι δύσκολη λόγω της ανάγκης για μια ισχυρή επιφάνεια στήριξης για πολλούς.
Ιδιότητες των οργανισμών
Οι οργανισμοί που περιέχουν μόρια ανασυνδυασμένου DNA έχουν προφανώς φυσιολογικούς φαινότυπους. Η εμφάνιση, η συμπεριφορά και ο μεταβολισμός τους συνήθως δεν αλλάζουν. Ο μόνος τρόπος για να αποδειχθεί η παρουσία ανασυνδυασμένων αλληλουχιών είναι να εξεταστεί το ίδιο το DNA χρησιμοποιώντας τη δοκιμή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.
Σε ορισμένες περιπτώσεις, το ανασυνδυασμένο DNA μπορεί να έχει επιβλαβείς επιπτώσεις. Αυτό μπορεί να συμβεί όταν το θραύσμα του που περιέχει έναν ενεργό προαγωγέα βρίσκεται δίπλα σε ένα προηγουμένως σιωπηλό γονίδιο κυττάρου ξενιστή.
Χρήση
Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιείται ευρέως στη βιοτεχνολογία, την ιατρική και την έρευνα. Οι πρωτεΐνες και άλλα προϊόντα του βρίσκονται σχεδόν σε κάθε δυτικό φαρμακείο, κτηνιατρική κλινική, ιατρείο, ιατρικό ή βιολογικό εργαστήριο.
Η πιο κοινή εφαρμογή είναι στη βασική έρευνα, όπου η τεχνολογία είναι απαραίτητη για μεγάλο μέρος της σημερινής εργασίας στις βιολογικές και βιοϊατρικές επιστήμες. Το ανασυνδυασμένο DNA χρησιμοποιείται για την αναγνώριση, χαρτογράφηση και αλληλουχία γονιδίων και για τον προσδιορισμό τουςλειτουργίες. Οι ανιχνευτές rDNA χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε μεμονωμένα κύτταρα και σε ιστούς ολόκληρων οργανισμών. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήρια σε εργαστηριακά πειράματα. Μερικά συγκεκριμένα παραδείγματα δίνονται παρακάτω.
Ανασυνδυασμένη χυμοσίνη
Βρίσκεται στο abomasum, η χυμοσίνη είναι ένα ένζυμο που απαιτείται για την παρασκευή τυριού. Ήταν το πρώτο γενετικά τροποποιημένο πρόσθετο τροφίμων που χρησιμοποιήθηκε στη βιομηχανία. Ένα μικροβιολογικά παραγόμενο ανασυνδυασμένο ένζυμο δομικά ίδιο με ένα ένζυμο που προέρχεται από μόσχο είναι φθηνότερο και παράγεται σε μεγαλύτερες ποσότητες.
Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη
Σχεδόν αντικατέστησε την ινσουλίνη που προέρχεται από ζωικές πηγές (π.χ. χοίρους και βοοειδή) για τη θεραπεία του ινσουλινοεξαρτώμενου διαβήτη. Η ανασυνδυασμένη ινσουλίνη συντίθεται με την εισαγωγή του γονιδίου ανθρώπινης ινσουλίνης σε βακτήρια του γένους Eterichia ή ζυμομύκητα.
Αυξητική ορμόνη
Συνταγογραφείται για ασθενείς των οποίων η υπόφυση δεν παράγει αρκετή αυξητική ορμόνη για να υποστηρίξει τη φυσιολογική ανάπτυξη. Πριν γίνει διαθέσιμη η ανασυνδυασμένη αυξητική ορμόνη, ελήφθη από την υπόφυση των πτωμάτων. Αυτή η μη ασφαλής πρακτική έχει οδηγήσει ορισμένους ασθενείς να αναπτύξουν νόσο Creutzfeldt-Jakob.
Ανασυνδυασμένος παράγοντας πήξης
Πρόκειται για πρωτεΐνη πήξης του αίματος που χορηγείται σε ασθενείς με μορφές αιμορροφιλίας με αιμορραγικές διαταραχές. Δεν είναι σε θέση να παράγουνπαράγοντα VIII σε επαρκείς ποσότητες. Πριν από την ανάπτυξη του ανασυνδυασμένου παράγοντα VIII, η πρωτεΐνη παρασκευαζόταν με επεξεργασία μεγάλων ποσοτήτων ανθρώπινου αίματος από πολλαπλούς δότες. Αυτό είχε πολύ υψηλό κίνδυνο μετάδοσης μολυσματικών ασθενειών.
Διάγνωση μόλυνσης από HIV
Κάθε μία από τις τρεις ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους για τη διάγνωση της HIV λοίμωξης αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο DNA. Ένα τεστ αντισωμάτων χρησιμοποιεί την πρωτεΐνη της. Ανιχνεύει την παρουσία γενετικού υλικού HIV χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής. Η ανάπτυξη του τεστ κατέστη δυνατή με τη μοριακή κλωνοποίηση και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων του HIV.
