Η PCR, ή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, είναι μια εξελιγμένη εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως στην ιατρική και σε άλλα επιστημονικά πεδία. Τα διαγνωστικά PCR κάποτε έγιναν μια πραγματική ανακάλυψη στην επιστήμη.
Περιγραφή
Η ποσοτική PCR είναι ένας τύπος PCR σε πραγματικό χρόνο.
Αυτό εννοείται ως παραλλαγή της PCR, στην οποία η κινητική της αντίδρασης καταγράφεται συνεχώς, γεγονός που καθιστά δυνατή την ποιοτική αξιολόγηση του περιεχομένου συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων DNA σε ένα σύνθετο μοριακό μείγμα.
Η μέθοδος ποσοτικής PCR θα συζητηθεί με περισσότερες λεπτομέρειες παρακάτω.
Η ουσία της ανάλυσης
Πολιτιστικές και ορολογικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται ιδιαίτερα συχνά για τη διάγνωση λοιμώξεων. Σύμφωνα με την πρώτη, προσδιορίζονται τα αντισώματα σε ένα μολυσματικό παθογόνο στον ορό του αίματος. Στο δεύτερο, βιολογικό υλικό που λαμβάνεται από ένα άρρωστο άτομο χρησιμοποιείται για τη σπορά ενός συγκεκριμένου μέσου που είναι ευνοϊκό για την ανάπτυξη αποικιών παθογόνων. Διαγνωστικά και στα δύοπερίπτωση μπορεί να διαρκέσει ημέρες ή εβδομάδες.
Η εξέταση PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί με διαφορετικά βιολογικά υλικά που λαμβάνονται από ένα άρρωστο άτομο. Το αίμα και άλλα παθολογικά, φυσιολογικά και βιολογικά μέσα και υγρά δρουν ως δείγματα. Μπορείτε να κάνετε PCR κόπρανα ή ούρα.
Οι άτυπες και ιογενείς λοιμώξεις διαγιγνώσκονται συχνότερα με ποσοτική PCR, καθώς μπορεί να μην είναι εύκολο να διαγνωστούν λόγω της ειδικής φύσης της παθολογικής διαδικασίας που προκαλούνται από αυτές. Για τον προσδιορισμό τέτοιων λοιμώξεων, χρειάζεται χρόνος, κατά τον οποίο αρχίζουν να παράγονται αντισώματα στο σώμα, που προσδιορίζονται με ορολογικές μεθόδους. Αλλά αυτό είναι απαράδεκτο σε ορισμένες περιπτώσεις.
Μέθοδος διεξαγωγής
Μέθοδος PCR - εργαστηριακή ανίχνευση λοίμωξης σε δείγματα που απομονώθηκαν από τον ασθενή (in vitro).
Για τη διεξαγωγή μιας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, απαιτείται ένα σύνολο ειδικών αντιδραστηρίων.
Το υλικό δοκιμής εισάγεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με αντιδραστήρια. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε μια ειδική συσκευή - έναν ενισχυτή PCR, ο οποίος έχει σχεδιαστεί για να ενισχύει (να αυξάνει τον αριθμό) των επιθυμητών τμημάτων RNA ή DNA, ο ενισχυτής PCR λειτουργεί σε κυκλικό τρόπο. Σε οποιονδήποτε κύκλο, εάν τα δείγματα περιέχουν την αλληλουχία RNA ή DNA του παθογόνου, τότε όλο και περισσότερα αντίγραφα των σωματιδίων αυτών των νουκλεϊκών οξέων συσσωρεύονται στο διάλυμα. Μπορείτε να προσδιορίσετε την παρουσία του παθογόνου και την ποσότητα του στα δείγματα.
Τύποι PCR
Η ποιοτική ανάλυση με PCR σάς επιτρέπει να λάβετε το ακόλουθο αποτέλεσμα:
- αρνητικό όταν το παθογόνο ενδιαφέρον δεν ανευρίσκεται στα δείγματα;
- θετικό εάν βρεθούν αλληλουχίες στα δείγματα που είναι χαρακτηριστικές ενός συγκεκριμένου παθογόνου.
Με ένα θετικό αποτέλεσμα PCR, μπορούμε να μιλήσουμε με 95% ακρίβεια για την παρουσία διαγνωσμένης λοίμωξης. Ταυτόχρονα, η ακρίβεια των σετ PCR που χρησιμοποιούνται για διαγνωστικούς σκοπούς φτάνει το 100%.
Συνήθως το 5% των εσφαλμένων αποτελεσμάτων καθορίζεται από τον ανθρώπινο παράγοντα. Για παράδειγμα, οι παραβιάσεις της τεχνικής ανάλυσης και αποθήκευσης αντιδραστηρίων μπορούν να μειώσουν σημαντικά την ακρίβεια της μελέτης.
Η ποσοτική PCR ορίζει την έννοια του ιικού φορτίου. Είναι δυνατό να προσδιοριστεί πόσα σετ DNA παθογόνου ήταν στα δείγματα που ελήφθησαν από τον ασθενή.
Η σοβαρότητα της μόλυνσης είναι ευθέως ανάλογη με την αύξηση του αριθμού τους. Μπορείτε επίσης να προσδιορίσετε την επιτυχία της θεραπείας για τη μείωση του ιικού φορτίου.
Υποβολή για βιοϋλικό PCR
Η ποσοτική PCR πραγματοποιείται στην κλινική, κυρίως το πρωί. Κατά τη διάρκεια μιας επίσκεψης στον γιατρό, ο ασθενής θα ενημερωθεί για το τι πρέπει να ληφθεί: ξύσιμο, επιχρίσματα, ούρα ή αίμα. Η PCR μπορεί να ανιχνεύσει παθογόνα ανεξάρτητα από το επίπεδο μόλυνσης του υλικού.
Για θετική ανάλυση, θεωρητικά, απαιτείται η παρουσία μόνο ενός παθογόνου στα δείγματα. Στην πράξη προσπαθούν να δημιουργήσουν ακόμη πιο ευνοϊκές συνθήκες. Υπάρχουν μερικές συστάσεις για αυτό:
- αν πάρουν ξύσιμο ή μπατονέτα από τα γεννητικά όργαναοργάνων, πρέπει να απέχετε από στενή επαφή τρεις ημέρες πριν από τη μελέτη·
- δεν μπορείτε να κάνετε ντους με αντιβακτηριακά φάρμακα ή να πλυθείτε πριν την ανάλυση.
- τρεις ώρες πριν πάρετε ένα επίχρισμα από την ουρήθρα, πρέπει να είστε υπομονετικοί και να μην αδειάζετε τα έντερά σας.
Μην ακολουθείτε αυτούς τους κανόνες κατά την αιμοδοσία.
Πώς ερμηνεύονται τα αποτελέσματα της ποσοτικής ανάλυσης PCR;
Ποσοτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν
Σε μια σειρά κλινικών καταστάσεων, εμφανίζεται το πρόβλημα της αποτελεσματικότητας της θεραπείας ή/και της δυναμικής της παθολογικής διαδικασίας. Τέτοιες ερωτήσεις είναι ιδιαίτερα σημαντικές κατά την εξέταση ατόμων με χρόνιες λοιμώξεις (ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, ηπατίτιδα Β και C). Κατά τη διάγνωση, βασίζονται στο γεγονός ότι η συσσώρευση αμπλικονίων (προϊόντα PCR) είναι ανάλογη με την παρουσία αντιγράφων του επιθυμητού γονιδίου στο αναλυόμενο δείγμα.
Φυσικά, λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της ποσοτικής PCR γίνεται με ηλεκτροφόρηση gel με τη μελέτη της έντασης των ειδικών σημάτων PCR. Επίσης, προϋπόθεση για μια σωστή ποσοτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται είναι θετικά αξιόπιστα δείγματα ελέγχου που περιέχουν γνωστό αριθμό αντιγράφων του επιθυμητού γονιδίου (για παράδειγμα, χίλια αντίγραφα του γονιδίου της ηπατίτιδας C για μία αντίδραση PCR). Αρκετές σειριακές αραιώσεις του ποσοτικού μάρτυρα επιτρέπουν τη δημιουργία καμπυλών βαθμονόμησης και χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση του περιεχομένου των κλινικών γονοτυπιών σε κλινικά δείγματα.
Στον ορισμό της ποσοτικής PCR, ένα βασικό επίτευγμα ήταν η δημιουργίαΦθορίζοντες ανιχνευτές DNA που προστίθενται στο μείγμα της αντίδρασης ταυτόχρονα με απλούς εκκινητές και σας επιτρέπουν να παρακολουθείτε έγκαιρα τη διαδικασία PCR, δηλαδή PCR σε πραγματικό χρόνο.
Η μεθοδολογία TaqMan αναφέρεται στη σύνθεση ανιχνευτών φθορίζοντος DNA που είναι ειδικοί για το μεσαίο τμήμα του αμπλικονίου και έχουν δύο ετικέτες στα άκρα. Το ένα από αυτά είναι μια φθορίζουσα ετικέτα, το δεύτερο είναι ένα σβηστικό μόριο για αυτόν τον φθορισμό.
Μια ειδική συσκευή, η οποία είναι ένα υβρίδιο ενός φθορόμετρου και ενός ενισχυτή thermoblock, κάνει σταθερές μετρήσεις φθορισμού σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα (αρχή PCR σε πραγματικό χρόνο). Μετά από 20-40 κύκλους PCR, θα ληφθούν μεμονωμένες καμπύλες για κάθε δείγμα. Ο αριθμός των αντιγράφων του επιθυμητού γονιδίου που περιέχεται στο δείγμα δοκιμής μπορεί να υπολογιστεί από τις καμπύλες βαθμονόμησης με δείγματα ελέγχου.
Επίσης, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της εφαρμογής της PCR με τη μέθοδο φθορισμού είναι ότι δεν χρειάζεται να ανοίξουμε σωλήνες με μείγμα PCR όταν λαμβάνονται υπόψη τα αποτελέσματα. Αυτό μειώνει την πιθανότητα μόλυνσης του δωματίου με προϊόντα ενίσχυσης και δεν χρειάζεται να διατεθούν ειδικοί χώροι εργασίας για ηλεκτροφόρηση.
Τι δείχνει μια ποσοτική μεταγραφή PCR;
Τι ανακαλύπτεται;
Μέσω μιας μεθόδου όπως η ποσοτική PCR, εντοπίζονται ποιοτικές αλλαγές στα γονίδια: εισαγωγές, διαγραφές και σημειακές μεταλλάξεις. Αλλά με ορισμένες κληρονομικές διαταραχές, τα αντίστοιχα συμπτώματα εμφανίζονται ως απόκριση σε μια αλλαγή στο περιεχόμενο ορισμένων γονιδίων.
ΕυχαριστώΗ ποσοτική ανάλυση δίνει ένα αριθμητικό αποτέλεσμα, πιο συχνά σε IU / ml. Αυτό σημαίνει ότι σε ένα χιλιοστόλιτρο του δείγματος δοκιμής, βρέθηκε ένας ορισμένος αριθμός αντιγράφων του RNA ή του DNA του παθογόνου, που μετρήθηκαν σε διεθνείς μονάδες.
Ανάλογα με το μέγεθος, διαγιγνώσκεται η σοβαρότητα της λοίμωξης. Το αίμα συνήθως ελέγχεται για τον προσδιορισμό του ιικού φορτίου, καθώς οι ιοί κινούνται ελεύθερα στο αίμα κατά τη διάρκεια της ασθένειας.
Λειτουργίες
Η ποσοτική PCR σε μια εξέταση αίματος έχει δύο χαρακτηριστικά.
- Η ανάλυση πραγματοποιείται παρουσία εκκινητών ή τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοζιτών, οι οποίοι είναι επισημασμένοι με φθορίζουσα ή ραδιενεργή ετικέτα για τον ακριβή προσδιορισμό της περιεκτικότητας του σχηματιζόμενου προϊόντος PCR.
- Στη διαδικασία PCR, τερματίστε την αντίδραση νωρίς πριν εμφανιστούν πάρα πολλά προϊόντα PCR. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι στο τελικό στάδιο του κορεσμού, όταν υπάρχουν πολλά προϊόντα PCR, τόσο το ίδιο το ένζυμο όσο και τα υποστρώματα λειτουργούν ως περιοριστικοί κρίκοι αυτής της αντίδρασης. Το τέλος του επόμενου κύκλου PCR υπό τέτοιες συνθήκες δεν χαρακτηρίζεται πλέον από διπλασιασμό του αριθμού των προϊόντων PCR, ισοπεδώνονται ασήμαντες ποσοτικές διαφορές μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων, οι οποίες ορίζονται σαφώς στα αρχικά στάδια μετά τη διέλευση από μια σειρά κύκλων αντίδρασης.
Κόστος διαγνωστικών PCR
Η έρευνα PCR έχει ένα κόστος, το οποίο εξαρτάται από το είδος της λοίμωξης που θα ελεγχθεί, από τη μεθοδολογία ανάλυσης και το υλικό δοκιμής. Για να προσδιορίσετε μία μόλυνση, θα πρέπει να δώσετε μέσα200-800 ρούβλια. Προστίθεται επίσης ένα τέλος για τη λήψη βιοϋλικού - περίπου 400 ρούβλια.
